Title: SUMÁRIO
Author: Andreia Saldanha
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conjugado baseado em anticorpo monoclonal para uso em diagnóstico de leptospirose
Fernandes, C.P.H.; Coutinho, M.L.; Santos, P.C.^* ; Goulart, K.L.; Vasconcellos, F.A.; Conceição, R.C.S.; Moreira, Â.N.; Goularte, F.L.; Aleixo, J.A.G^1.
^1Laboratório de Imunologia Aplicada – Centro de Biotecnologia – CenBiot/UFPEL
Campus Universitário  – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900  
_* paulavet10@hotmail.com.br

1.	INTRODUÇÃO

A leptospirose é um zoonose de distribuição mundial. A doença caracteriza-se por um amplo espectro de manifestações clínicas em humanos, podendo variar das formas mais graves como o Síndrome descrito por WEIL em 1886 ou o Síndrome Pulmonar Agudo, às formas mais brandas, acompanhadas ou não de febre alta, que podem ser confundidas com a gripe comum [4]. A apresentação da forma leve da doença não impede que evolua para um quadro clínico grave e os sintomas dependem, com freqüência, do diagnóstico das formas leves e a sua inclusão nas estatísticas [2]. Assim, o diagnóstico precoce da doença é muito importante para que o tratamento seja prontamente instituído. 
Os teste diagnósticos da leptospirose baseiam-se principalmente na detecção de anticorpos sendo o ELISA um dos testes mais utilizados [5]. Este teste utiliza uma reação enzimática para a detecção do complexo antígeno anticorpo. A enzima usada na detecção pode ser conjugada a anticorpos primários, que reagem diretamente com o antígeno ou a anticorpos secundários, anti-espécie específicos, que detectam o complexo imune indiretamente[1, 3].
Neste trabalho se descreve a produção e avaliação em testes ELISA de um conjugado composto da enzima peroxidase e de um anticorpo monoclonal (Mab) específico para uma proteína de membrana externa de Leptospiras patogênicas

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Foi utilizado um anticorpo monoclonal específico para uma proteína de membrana externa, recombinante, de Leptospira patogênica. O anticorpo com a concentração de 10mg/ml foi submetido à conjugação com enzima peroxidase, pelo método do periodato [7]. Resumidamente, 5mg de enzima peroxidase foi dissolvida em água ultra pura e a ela adicionada 250μl de periodato de sódio 0,1M. Após diálise contra tampão acetato 0,1M pH 4.4 a 4^0C, foi adicionado 250μl de tampão carbonato 0,2 M pH 9.5. A esta preparação foi adicionado o anticorpo, na concentração de 10 mg/ml em tampão carbonato 0,01 M pH 9.5 e submetida a agitação durante duas horas a temperatura ambiente. Finalmente, foi adicionado 114μl de tetraborato de sódio, concentração de 4mg/ml e incubado a 4^0C durante 2 horas. A preparação foi recolhida e estocada a - 20^0C. O conjugado foi testado em dois formatos de ELISA. Para o ELISA direto, usado para determinar o título do conjugado, foi utilizada a concentração de 150ng/poço de proteína recombinante. Para o ELISA sandwich, usado para determinar o limite de detecção do teste, a concentração de 200ng/poço de soro policlonal de coelho contra Leptospira interrogans e a proteína recombinante foi distribuída nas concentrações de 500; 250; 125; 75; 37,5; 18,75 ng/poço. A adsorção das proteínas às placas de poliestireno foi realizada em tampão carbonato- bicarbonato 0,05M, pH 9,5, por 16 horas à 4^0C. Os outros passos do ELISA foram feitos com incubações à 37^oC por 1 hora. Para a lavagem de placas e diluições dos reagentes foi utilizado PBS com 0,5% de Tween 20. A solução cromógeno-substrato continha peróxido de hidrogênio e OPD e a leitura da reação foi feita a 450nm em leitor de ELISA.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na titulação do conjugado Mab peroxidase no ELISA indireto com a proteína recombinante (Figura 1) a diluição ótima de uso estabelecida foi de 1: 5.000, com absorbância a 450nm de 0,60 indicando um bom potencial de uso no sistema ELISA, sendo possível a sua utilização em altas diluições, como já descrito por outros conjugados primários e anti espécie específicos[6]. 
Quando o conjugado Mab peroxidase foi avaliado em teste ELISA sandwich, utilizando para adsorção na placa, de um anticorpo de coelho policlonal contra Leptospira interrogans como anticorpo de captura, foi capaz de detectar antígeno até a concentração de 31,25ng/poço (Figura 2) . 
O conjugado Mab Peroxidase anti proteína recombinante de Leptospira patogênica detecta este antígeno capturado por anticorpos adsorvidos à placa, sugerindo que a sua utilização em testes diagnósticos ELISA, que utilizam anticorpos para a captura de antígeno, é possível.

Figura 1. Curva de titulação do conjugado em ELISA direto

Figura 2. Valores de absorbância nas diferentes concentrações de antígeno aplicadas para reação com soro policlonal e detecção pelo conjugado no ELISA sandwich.

4. CONCLUSÕES

O conjugado Mab peroxidase produzido possui potencial para utilização em ensaios ELISA nos formatos sandwich e direto, quando for necessária a detecção do antígeno de Leptospiras patogências no soro de diferentes espécies.
		Mais estudos são necessários para a padronização dos testes com soros de diferentes espécies, naturalmente imunizados.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] CROWTHER, J.R. The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Biology, v.149. Humana Press, N.J. 421p., 2001.
[2] FAINE, S. 1982. Guidelines for the Control of Leptospirosis. Geneve, World Health Organization, ( Who Offset Publication n^o 67).
[3] HARLOW E., LANE D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 726 p., 1988.
[4] Human Leptospirosis, Guidance for Diagnosis Surveillance and Control. WHO Publication Cataloging, 122 p., 2003 
[5] LEVETT, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews, 2001, v 14, n.2, p. 296-326.
[6] MARTIN, D. A.,MUTH, D.A., BROWN, T., ALISON, J.J., KARABATSOS, N., ROHERIG, J.T. Standartization of Immunoglobulin M Capture Enzime-Linked Immunosorbent Assays for Routine Diagnosis of Arboviral Infections. Journal of Clinical Microbiology, 2000, v.38, n.5, p. 1823-1826.
[7] WILSON, M.B., NAKANE P.K. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Practice and theory of enzyme immunoassays. p. 236, 1985.