ULTRA-ESTRUTURA DE COMPLEXOS CUMULUS-OOPHORUS COMPACTO DE EQÜINOS 

VELHO, Janaína1; CURCIO, Bruna Rosa2; LINS, Luciana1; ROSA, Alexandre1; LARVADA, Alexandre1; ALBUQUERQUE, Luiz Pedro1; NOGUEIRA, Carlos Eduardo W.3; DESCHAMPS, João Carlos4
1 Acadêmico Medicina Veterinária/UFPel; 2 Doutorando Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Agrícola/UFPel;  3Dep. Clinicas Veterinárias/FV/UFPel; 4Dep. Patologia Animal/FV/UFPel  
Campus Universitário s/n°-Caixa Postal 354 CEP 96010-900.janavelho@ibest.com.br

1. INTRODUÇÃO

O complexo cumulus-oophorus compreende o oócito propriamente dito e as células do cumulus, esses estão separados pelo espaço perivitelino e estabelecem ligações através das microvilosidades [4]. 
O oócito é formado pelo núcleo e citoplasma, sendo o último denominado ooplasma. Durante o crescimento dos oócitos existem mudanças na distribuição, no número e no tamanho das organelas citoplasmáticas do ooplasma. Essas mudanças têm sido estudadas em várias espécies [2,5]. 
Em oócitos suínos foi definido que as estruturas mais importantes a serem observadas, durante o processo de maturação, são: mitocôndrias, complexo de Golgi, grânulos corticais, vesículas com membrana e gotas lipídicas [1]. A observação no microscópio eletrônico permite avaliar cada uma dessas estruturas com precisão, sendo possível determinar o estágio de maturação e viabilidade do oócito pelas características de cada uma delas. 
O presente estudo teve como objetivo descrever características ultra-estruturais de complexos cumulus-oophorus compactos eqüinos, coletados de folículos entre 10 e 30 mm de diâmetro. 

2. MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados oócitos eqüinos provenientes de ovário de abatedouro, coletados através do método de scraping da parede de folículos entre 10 e 30 mm de diâmetro. 
Complexos cumulus-oophorus (CCO) compactos (n=10) foram selecionados e imediatamente fixados em glutaraldeido e paraformaldeído a 2%, por uma hora a temperatura de 4°C. Posteriormente os mesmos foram lavados três vezes (15 min cada lavado), em solução tampão de cacodilato de sódio 0,1M e sacarose 0,2M. Os CCO foram retirados da solução tampão e transferidos para tetróxido de ósmio a 1%, a temperatura de 4°C por duas horas. Após a fixação ósmica, foram lavados em água tridestilada, desidratados em concentrações crescentes de etanol/acetona (30, 50, 70, 90 e 100°GL) e incluídos em blocos de resina. A polimerização foi realizada em estufa por 24 horas a 80°C. Os blocos foram cortados em ultramicrótomo com navalha de diamante. Os cortes ultrafinos (50-70 nm) foram coletados em grades de cobre de 200 mesh e contrastados por acetato de uranila e citrato de chumbo. Esses cortes foram observados e fotografados em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss-EM109). 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

 Para a realização do estudo foram avaliados 10 CCO compactos de eqüinos. Dois oócitos apresentaram células do cumulus dispersas demonstrando núcleo picnótico e sinais de apoptose, além de tumefação na matriz mitocondrial (Figura 1) e tumefações nas cisternas do complexo de golgi. As características, das organelas desses dois CCO, são compatíveis com a ocorrência de degeneração celular. A coleta de oócitos degenerados pode ter ocorrido devido à escolha aleatória dos ovários no abatedouro, independente da idade das éguas.
O restante dos CCO (80%) apresentou ótimo estado de conservação. Foram observadas mitocôndrias em formato oval e alongado, com as criptas evidentes. Essas estavam distribuídas por todo citoplasma, com tendência a formação de grupos (Figura 2). Em oócitos maturos de suínos, as mitocôndrias apresentam-se em formato de ferradura e com poucas criptas [1]. 
Foram identificados poucos grânulos corticais nos oócitos (Figura 2), os quais estavam dispersos no ooplasma, caracterizando oócito imaturo [6]. Em oócitos maturos, os grânulos corticais apresentam-se esféricos, densos, com tamanho e forma homogêneos, formando monocamada sob a membrana citoplasmática [6]. O complexo de golgi dos oócitos apresentou-se formado por duas ou três cisternas e circundado por numerosas vesículas esféricas.
Foi observada zona pelúcida (ZP) com estrutura fibrilar, rica em junções que realizam a união entre as microvilosidades do oócito e as projeções das células do cumulus (Figuras 3 e 4).  Essa estrutura fibrilar da ZP foi descrita anteriormente em oócitos eqüinos [5] e suínos [1]. 
Foram também observadas gotas lipídicas (GL) esféricas, sem membrana delimitante, medianamente eletrodensas e, algumas vezes, circundada por halo eletrolúcido. A presença do halo eletrolúcido pode significar que as GL são compostas, em sua maioria, por ácidos graxos insaturados ou que os lipídios que as compõem já iniciaram a metabolização [3].
As características na conformação e distribuição das organelas citoplasmáticas dos oócitos, sugerem que CCO compactos eqüinos, recuperados de folículos entre 10 e 30 mm de diâmetro, encontram-se imaturos no momento da coleta. 

ZP

                Fig.3- Zona Pelúcia (ZP), demonstrando	     Fig. 4 – Junção tipo desmossomo (      )
junções (     ) entre microvilosidades      	          na zona pelúcida (x 20.000)
	e células do cumulus (x 7000)

4. CONCLUSÕES

Devido às características ultra-estruturais encontradas pode-se concluir que complexo cumulus-oophorus compactos eqüinos encontram-se imaturos no momento da coleta. 

AGRADECIMENTOS

Ao laboratório de microscopia eletrônica da Faculdade de Veterinária/UFPel, pelos serviços prestados na realização do experimento.
Ao Professor Severo Salles de Barros (UFSM) pelo fundamental apoio e conhecimento transmitido durante o desenvolvimento do trabalho.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] CRAN, D.G. Qualitative and quantitative structural changes during pig oocytes maturation. Journal of Reproduction and Fertility, 1985, 74, p.237-245.
[2] FERNANDES C. B. Maturação in vitro de ovócitos eqüinos: comparação entre meios TCM 199, SOFaa e HTF: BME, e avaliação da adição de FSH bovino, FSH eqüino e do hormônio do crescimento eqüino por meio da transferência de ovócito. Botucatu, 2004, 129 p, Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária), Pós-graduação em Medicina Veterinária, UNESP, 2004.
[3] GHADIALLY, F.N. Cytoplasmatic matrix and its inclusions. In: GHADIALLY, F.N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. London: Butterworths, 1988, p. 953-1042.  
[4] HAFEZ, E. S. E. Foliculogênese, maturação do ovo e ovulação. In: HAFEZ, E. S. E., Reprodução Animal. São Paulo: Ed. Manole, 1995, p.115-145.
[5] PEREIRA, J. M. Maturação in vitro de oócitos eqüinos: Influência do tempo, LH e FSH. Santa Maria, 1997, 89 p, Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Pós-graduação em Medicina Veterinária, UFSM, 1997.
[6] WILLIS, P.; CAUDLE, A.B.; FAYER-HOSKEN, R.A. Fine structure of equine oocytes matured in vitro for 15 hours. Molecular Reproduction and Development, 1994, 37, p.87-92.