OCORRÊNCIA DE MANCHA FOLIAR EM ORQUÍDEA DE CHÃO (Phaius tankervilleae, Fothergill) CAUSADA POR Xanthomonas sp.

ARDUIM, Gisele da Silva12; SANTOS, Juliano dos12; BRANCÃO, Mirian13; MOURA, Andréa Bittencourt14
1Universidade Federal de Pelotas/FAEM - Departamento Fitossanidade, 2 mestranda/ bolsista CAPES, 3doutoranda/ bolsista/ CAPES, 4 pesquisadora; giselearduim@yahoo.com.br

INTRODUÇÃO

A orquídea de chão (Phaius tankervilleae, Fothergill) conhecida popularmente como capuz-de-freira graças ao formato e disposição das flores é uma ornamental originária da China. Essa orquídea pertence à família Orchidaceae, especialmente terrestre, herbácea e perene, apresentando porte robusto e ereto, alcançando até 1m quando está florida. Por ser uma planta ornamental comercializada para cultivo em vaso, é fundamental que se tenham plantas sadias, e por isso, a diagnose e o controle de doenças é muito importante {5}. 
Diversos patógenos já foram relatados infectando espécies de orquídeas de gênero Phaius, tais como: Sclerotium rolfsii {2}, Vírus do mosaico do Cymbidium (CymMV) {4, 8}, Enterobacter cloacae {11} e Phytophthora spp.; {1}
Observou-se, em viveiro comercial no Capão de Leão - RS, plantas de orquídea de chão (P. tankervilleae) que apresentavam manchas necróticas alongadas nas folhas, circundada por halo de coloração amarelada que posteriormente tomaram toda a folha, apresentando então, coloração marrom (Figura 01). A análise das folhas em laboratório permitiu observar a presença de fluxo bacteriano. Os sintomas observados eram distintos dos verificados na literatura, então, o objetivo deste trabalho foi isolar e identificar o agente causal que afeta plantas de orquídea.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolamento e obtenção de culturas puras: Fragmentos de tecidos com fluxo bacteriano foram desinfestados em álcool 50%, hipoclorito de sódio 2% e lavados em água destilada estéril. Maceraram-se os tecidos infectados, deixando-os em repouso, semeando-se em placas de Petri contendo meio 523 {5} pelo método de estrias ou riscas {9}. As placas foram incubadas a 28ºC, por 24 a 72 horas, repicando-se as colônias individualizadas em tubos com meio inclinado. 
Teste de patogenicidade: Este ocorreu em duas formas: no primeiro, usou-se uma tesoura previamente mergulhada em suspensão bacteriana de cada isolado, com 24 horas de idade e com uma OD540= 0,3 realizando com ela, cortes nas bordas das folhas. No segundo método, foram feitas picadas, com alfinetes estéreis, tocando-os nas colônias e introduzindo-os em vários pontos nas folhas. Como testemunha, folhas foram inoculadas pelos dois métodos apenas com água destilada e esterilizada. Duas folhas, uma de cada método de inoculação, foram colocadas em gerbox previamente desinfestados, contendo duas camadas de papel filtro umedecidos e incubados a 28°C até o surgimento dos sintomas, procedeu-se à observação da exsudação do fluxo bacteriano e ao reisolamento. 
Testes bioquímicos: Os testes para a determinação do gênero foram: método tintorial de coloração de Gram {7}, anaerobiose pelo método de jarra de anaerobiose, pelo método de lamínula em placa de Petri {7}, utilização de asparagina como única fonte de carbono e nitrogênio {7} e produção de xantomonadina {10}. As provas para a caracterização dos isolados patogênicos foram: presença de catalase {7} e oxidase {7}, crescimento a 35°C {10}, hidrólise de esculina {7}, de amido {7} e de gelatina {7}, proteólise do leite {10}, produção de urease {7}, produção de ácido a partir de: arabinose {7, 10}, celobiose {7}, manose {7}, trealose {7} e glicose {7}, e utilização de glicerol {7}. Como complemento aos testes acima descritos, foi utilizada também a bateria de provas bioquímicas comercialmente chamada de BAC–TRAY®, executada segundo normas do fabricante para os isolados patogênicos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram obtidos oito isolados, cujas colônias eram amarelo claras, brilhantes, circulares e de bordos lisos. Dos oito isolados apenas três foram patogênicos (G2, G5 e G7) em folhas de orquídea de chão e reproduziram sintomas originais, onde o melhor método de inoculação utilizado foi por ferimento com alfinete. Foi feito reisolamento e as colônias obtidas eram idênticas às originais, cumprindo-se, assim, os postulados de Koch. Serão mostrados os resultados dos isolados patogênicos embora todos os isolados fossem bastonetes Gram negativos, aeróbicos estritos, produtores de xantomonadina (figura 02) e não utilizassem asparagina como única fonte de carbono e nitrogênio. Todas estas características descritas acima são compatíveis com a descrição do gênero Xanthomonas {7}. 
Os resultados obtidos apontam o gênero Xanthomonas como sendo o agente causal da mancha foliar em orquídea de chão (P. tankervillaea). Segundo a bibliografia, este gênero, que possui muitos representantes fitopatogênicos, ainda não teve sua ocorrência descrita para este gênero ornamental.
Os dados da caracterização dos isolados em estudo (Tabela 01) não permitiram determinar a espécie causadora da doença na orquídea de chão, embora tenha sido determinado o comportamento dos isolados para 31 características bioquímicas. Ressalta-se que o comportamento para a utilização de celobiose, cetrimida, glicerol e manose, foi diferenciado entre os isolados avaliados, tendo o isolado G5 sempre apresentado resultados negativos para estas provas bioquímicas, mesmo após estas serem repetidas para todos os isolados. Por outro lado, de acordo com o Manual de Bergey {3} os resultados das provas fisiológicas e bioquímicas representam o comportamento de pelo menos 80% dos isolados de uma espécie, o que poderia justificar o comportamento do isolado G5.

(A)

(B)
Figura 01: Sintomas naturais (A) e sintomas produzidos por inoculação artificial por ferimento com alfinete em folhas de orquídea de chão (B), incitados por Xanthomonas.

Figura 02: Espectro de absorção de extratos metanólicos obtidos de isolados bacterianos patogênicos de folhas de orquídea de chão.

Tabela 01: Características bioquímicas utilizadas para a caracterização dos isolados obtidos de orquídea de chão.
Característica	2	5	7	 Característica	2	5	7	
Hidrólise de gelatina	+	+	+	 Prod. de acetoina	-	-	-	
Hidrólise de amido	-	-	-	 Indol	-	-	-	
Hidrólise de esculina	+	+	+	 Malonato	-	-	-	
Urease	-	-	-	 Rhamnose	-	-	-	
Oxidase	-	-	-	 Adonitol	-	-	-	
Utilização de arabinose	+	+	+	 Salicina	-	-	-	
Utilização de glicose	-	-	-	  Inositol	-	-	-	
Utilização de manose	+	-	+	 Sorbitol	-	-	-	
Utilização de trealose	-	-	-	 Sacarose	-	-	-	
Utilização de celobiose	+	-	+	 Manose	-	-	-	
Utilização de glicerol	+	-	+	 Rafinose	-	-	-	
Crescimento a 35°C	-	-	-	Cetrimida	+	-	+	
Catalase	-	-	-	Acetamida	-	-	-	
Prod. de ß-Galactosidase	-	-	-	Citrato	-	-	-	
L. Arginina	-	-	-	Maltose	-	-	-	
H2S	-	-	-					
(+) = reação positiva; (-) = reação negativa. Prod.= Produção
CONCLUSÃO
A determinação da espécie de Xanthomonas em questão, faz-se necessário a realização de outros testes baseados em métodos bioquímicos, quiçá moleculares.  

LITERATURA CITADA

1 - ANN, P. J. Phytophthora diseases of orchids in Taiwan. Plant Pathology Bulletin. 1995; 4 (4): 152 – 162.

2 - BAG, T. K. Two new orchid hosts of Sclerotium rolfsii from India. Plant pathology. 2004; 53 (2): 255.
3 - FREITAS AUSTUA, J.; REZENDE, J. A. M.; KITAJIMA, E. W. Incidence of orchid viruses in the state of Sao Paulo, Brazil. Fitopatologia Brasileira. 1999; 24 (2): 125-130.

3 – HOELT, J. G.; KRIEG, N. R.; SNEATCH, P. H. A.; STALEY, J. T.; WILLIAMS, S. T. Bergey’s Manual® of Determinative Bacteriology. 9ª ed. Baltimore, USA, 1994; 787p. 

4 – FREITAS AUSTUA, J.; REZENDE, J. A. M.; KITAJIMA, E. W. Incidence of orchid víruses in the state of Sao Paulo, Brazil. Fitopatologia Brasileira, 1999; 24(2): 125-130.

5 - KADO, C.I.; HESKETT, M.G.  Selective media for isolation of Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas. Phytopathology, Saint Paul: v. 60, p. 969 - 979,1970. 

6 - LORENZI, H.; SOUZA, H. M. Plantas ornamentais do Brasil: arbustivas, herbáceas e trepadeiras. 3ª edição. Nova Odessa – SP: Instituto Plantarum, 2001. 1088p.

7 - MARIANO, R. L. ROSA.  Manual de práticas em fitobacteriologia. Recife: UFPE, 2000. p. 171.

8 - MOREIRA, L.; VILLALOBOS, W.; RODRIGUEZ CEREZO, E.; RIVERA, C. First report of the cymbidium mosaic potexvirus (CymMV) infecting the terrestrial orchid Phaius tankervillieae in Costa Rica.  Revista de Biologia Tropical. 1999; 47 (3): 281 – 286.

9 - ROMEIRO, R. S. Métodos em Bacteriologia de Plantas. Viçosa. Imprensa Universitária, UFV, 2001. 279 p.

10 – SHAAD, N. W.; JONES, J. B.; CHUN, W. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 3 ed. St. Paul: The American Phytopathology Society, 2001. 373p.

11 - TAKAHASHI, Y.; TAKAHASHI, K.; SATO, M.; WATANABE, K.; KAWANO, T. Bacterial leaf rot of Odontioda orchids caused by Enterobacter cloacae. Annais of the Phytopathological Society of Japan. 1997; 63 (3): 164 – 169.